Stanovení glutathion-S-transferasy v lyzátech hepatocytů

Abstract

Glutathion-S-transferázy (GSTs) jsou multifunkční enzymy (cytosolické, mitochondriální a mikrosomální), podílející se na metabolismu širokého spektra xenobiotik včetně karcinogenů a endogenních látek. Tyto enzymy katalyzují nukleofilní reakci redukovaného glutathionu s nepolárními sloučeninami, které obsahují elektrofilní uhlík, dusík nebo atom síry. GSTs jsou také zapojeny v biosyntéze leukotrienů, prostaglandinů, testosteronu, progesteronu a v degradaci tyrosinu. GSTs mají také velký význam v antiastmatické a protinádorové terapii, neboť jsou schopny metabolizovat protirakovinná chemoterapeutika, karcinogeny a produkty oxidačního stresu. Naopak snížená hladina GST může vést k tvorbě nejrůznějších nádorů. GST aktivita se nejčastěji stanovuje spektrofotometricky při 340 nm. K tomuto stanovení se používá standardní substrát 1-chloro-2,4-dinitrobenzen, který je vhodný k detekci aktivity u ?, ? i ?-třídy GST isoenzymů a jako kosubstrát se používá glutathion. Tempo růstu absorbance je přímo úměrné GST aktivitě ve vzorku. Cílem této práce bylo testování vlivu různých parametrů metodiky (teplota, pH, doba inkubace, typ pufru) na stanovení aktivity glutathion-S-transferázy v lyzátech potkaních hepatocytů a u purifikované koňské GST a zjištění optimálních parametrů. Byly zjištěny tyto optimální parametry metodiky: draselný fosfátový pufr pH 7,4, T = 21 °C. Byl testován růst signálu v závislosti na koncentraci GSH a CDNB, kdy při koncentraci CDNB vyšší jak 3,6 mmol/l byl pozorován pokles aktivity. GST je stabilní při 4 °C po dobu 24 hodin, ale opakovaným zamražením/rozmražením se aktivita ztrácí. Dále byl sledován inhibiční vliv ethakrynové kyseliny na aktivitu GST. Aktivita ve vzorcích a standardu, vyjádřená v U/mg proteinu, byla porovnána s kontrolní aktivitou a byla vyjádřena jako procento kontrolního signálu. Při použití 50 ?M koncentrace EA činí aktivita GST ve vzorcích i standardu 14 % kontrolního signálu. Výhodou tohoto stanovení je časová nenáročnost a tím i možnost měření velkého množství vzorků během krátké doby. Mikromolární koncentrace ethakrynové kyseliny lze pravděpodobně použít u buněčných kultur nezávisle na jejich druhu k in vitro inhibici GST aktivity.